Hari ini, mari kita bincangkan masalah yang telah menyebabkan sakit kepala rakan sekerja penyelidikan - eksperimen Barat (WB). Ini seolah -olah mudah tetapi penuh dengan percubaan "perangkap", mengapa ia selalu membuat kita tersandung lagi dan lagi? Sekarang mari kita mengkaji sebab -sebab kegagalan bersama.
I. Tiada band
Sebab -sebab yang mungkin termasuk:
- Isu antibodi: Antibodi mungkin tidak berkesan, tidak spesifik, atau tidak mengikat protein sasaran.
- Isu sampel: Sampel mungkin mengandungi bahan yang mengganggu, terlalu rendah dalam kepekatan, atau telah terdegradasi.
- Isu Elektroforesis: Keadaan elektroforesis yang tidak sesuai, seperti voltan, masa, atau penggunaan penyangga yang tidak betul.
- Isu pemindahan: Masalah semasa proses pemindahan, seperti pemilihan membran yang tidak sesuai, masa pemindahan, atau penampan pemindahan.
- Isu menyekat: Penyelesaian penyekatan mungkin tidak sesuai atau masa menyekat mungkin terlalu lama.
- Isu Pewarnaan: Reagen pewarnaan boleh tamat tempoh, tidak sensitif, atau tidak digunakan secara tidak wajar.
Isu Peralatan: Peralatan boleh rosak atau tidak ditentukur dengan betul.
- Isu Operasi Eksperimen: Operasi eksperimen mungkin tidak diseragamkan, seperti pembasuhan yang tidak mencukupi atau pemuatan sampel yang tidak sekata.
- Isu Pengubahsuaian Protein: Protein sasaran mungkin menjalani pengubahsuaian selepas translasi yang menghalang pengiktirafan antibodi.
- Isu Ekspresi Protein Sasaran: Protein sasaran mungkin mempunyai ekspresi yang sangat rendah atau tiada ekspresi dalam sel atau tisu yang dikesan.
Ii. Latar belakang yang tinggi
Sebab -sebab yang mungkin termasuk:
- Kepekatan antibodi yang tinggi: Menggunakan terlalu banyak antibodi boleh meningkatkan pengikatan tidak spesifik, menghasilkan latar belakang yang tinggi.
- Isu Kualiti Antibodi: Antibodi mungkin mempunyai pengikatan tidak spesifik yang tinggi atau balas balas dengan protein lain.
- Penyekatan yang tidak mencukupi: Penyelesaian penyekatan gagal meliputi tapak pengikat yang tidak spesifik pada membran, mengakibatkan latar belakang yang tinggi.
- Isu membran: Membran mungkin mempunyai kualiti atau pencemaran yang buruk, yang membawa kepada latar belakang yang tinggi.
- Pemindahan yang tidak lengkap: Semasa proses pemindahan, protein mungkin tidak dipindahkan sepenuhnya ke membran, menghasilkan latar belakang yang tinggi.
- Basuh yang tidak mencukupi: Langkah -langkah pencucian gagal menghapuskan antibodi yang tidak teratur atau kekotoran lain, yang membawa kepada latar belakang yang tinggi.
- Isu Reagen Pewarnaan: Reagen pewarnaan mungkin terlalu sensitif atau tidak stabil, menyebabkan latar belakang yang tinggi.
- Isu Peralatan Eksperimen: Peralatan mungkin mempunyai kebocoran atau gangguan, yang membawa kepada latar belakang yang tinggi.
- Isu Sampel Protein: Sampel mungkin mengandungi sejumlah besar bahan yang mengganggu, seperti produk degradasi protein atau kekotoran lain.
- Isu Operasi Eksperimen: Operasi eksperimen mungkin tidak diseragamkan, seperti masa inkubasi yang berpanjangan atau suhu tinggi.
Iii. Band tidak spesifik atau saiz band protein yang salah
Sebab -sebab yang mungkin termasuk:
- Terlalu banyak petikan sel, menghasilkan tahap ekspresi protein yang berbeza, yang membawa kepada saiz band yang tidak konsisten atau kehadiran pelbagai band.
- Degradasi sampel protein, mengakibatkan berat molekul protein yang lebih rendah atau kehadiran pelbagai band.
- Dalam vivo menyatakan sampel protein mungkin mempunyai pelbagai bentuk pengubahsuaian seperti asetilasi, metilasi, alkilasi, fosforilasi, dan glikosilasi, yang membawa kepada saiz band yang tidak konsisten atau kehadiran pelbagai band.
- Protein sasaran mengandungi pelbagai isoforms atau varian sambatan, menghasilkan saiz band yang tidak konsisten atau kehadiran pelbagai band.
